Производные 1 4 бензодиазепина

Производные 1 4 бензодиазепина

15.1. ПРОБОПОДГОТОВКА

Подготовка пробы представляет собой жидко­стную экстракцию бензодиазепинов из мочи при рН=5 — 8. В случае анализа по нативным соединениям при этих значениях рН экстрагируются и другие вещества (слабые кислоты, слабые осно­вания, другие амфолиты), например барбитураты, которые при исследовании будут вносить интерференционный фон, что может привести к получению ложноположительных результатов.

При ана­лизе по производным — соответствующим бензофенонам — пробо- подготовка включает в себя предварительную (перед экстракцией) обработку биообъекта кислотой при нагревании, цель которой — перевести нативные соединения и их метаболиты в аминобензофе­ноны.

15.2. ВЫБОР УСЛОВИЙ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕН­ЗОДИАЗЕПИНОВ НА МИКРОКОЛОНОЧ- НОМ ЖИДКОСТНОМ ХРОМАТОГРАФЕ СЕ­РИИ «МИЛИХРОМ”

Для разделения 1,4-бензодиазепинов методом ВЭЖХ рекомендуются следующие условия:

— хроматографическая колонка (62 х 2 мм), заполненная обра- щенно-фазным сорбентом «Сепарон» С18 (5 мкм) (колонка постав­ляется с хроматографом);

— в качестве подвижной фазы (элюента) для разделения на­тивных бензодиазепинов (кроме медазепама) используется смесь 0,05 М водного раствора двузамещенного фосфата аммония и аце­тонитрила (65:35) — рН~7,б;

— детектирование нативных 1,4-бензодиазепинов проводится при длине волны 230 нм;

— в качестве элюента для разделения продуктов гидролитиче­ского расщепления нативных бензодиазепинов — бензофенонов (и медазепама) используется система тех же растворителей, но в соотношении 45:55;

— детектирование бензофенонов проводится при длине волны 220 нм;

— скорость потока элюирования — 100 мкл/мин.

15.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭЛЮЕНТА И ЭТА­ЛОННЫХ РАСТВОРОВ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ

а) В мерной посуде готовится раствор дигид­рофосфата аммония в дистиллированной воде — 0,5 М (раствор № 1). Для этого:

— на аналитических весах берется навеска 0,66 г дигидрофос­фата аммония (КН4)2НР04;

— навеска переносится в колбу на 100 мл, объем доводится дистиллированной водой до метки, и смесь встряхивается до полного растворения осадка.

б) Для приготовления 0,05 М раствора дигидрофосЛата аммония 10 мл раствора № 1 переносится в мерную колбу на 100 мл и объем доводится до метки дистиллированной водой (раствор № 2). Смесь встряхивается до полного перемешивания.

в) Для приготовления эталонных растворов сравнения анализи­руемых бензодиазепинов и бензофенонов используются чистые суб­станции гидазепама, оксазепама, нитразепама, хлордиазепоксида, феназепама, диазепама, медазепама, АНБ, АХБ, АБХБ и МХБ. Для этого:

— на лабораторных весах взвешивается по 25 ± 1 мг указанных веществ;

— навеска каждого вещества переносится в соответствующую отдельную колбу на 50 см3 и заполняется элюентом до метки; содержимое колбы встряхивается до полного растворения осадка.

Эталонные растворы сравнения анализируемых бензодиазепинов и бензофенонов могут сохраняться при +4°С в течение 3 месяцев. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, оп­ределения их хроматографических параметров, а также для при­готовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Элюент и эталонные растворы сравнения перед использованием необходимо очистить от механических примесей (пыль из атмос­феры, частицы вещества), которые могут забивать фильтры колонки и нарушать нормальную работу насоса и хроматографической ко­лонки.

Для удаления этих примесей используется владипоровская мембрана МФА-МА № 2 (ТУ 8-05-1903-84) с размером пор 0,15 — 0,25 мкм или мелкопористый стеклянный фильтр. Элюент перед работой необходимо пролегазировать в течение 10 минут. Для этого используется ток газообразного гелия (ТУ 51-940-80) при расходе 40 — 50мкл/мин, обработка на ультразвуковой бане или вакуум­ный насос.

15.4. АНАЛИЗ МОДЕЛЬНОЙ СМЕСИ 1,4- БЕНЗОДИАЗЕПИНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ИХ УДЕРЖИВАНИЯ

Тестовая модельная смесь гидазепама, оксазе- пама, нитразепама, хлордиазепоксида, феназепама и диазепама готовится в растворе подвижной фазы. Для этого:

а) берутся навески гидазепама (25 ± 1 мг), оксазепама (28 ± 0,5 мг), нитразепама (55 ± 0,5 мг), хлордиазепоксида (75 ± 1 мг), феназепама (19 ± 0,5 мг) и диазепама (50 ± 1 мг);

б) навески переносятся в колбу 50 см , объем доводится до метки, смесь встряхивается до полного растворения и фильтруется. Смесь должна сохраняться при + 4°С.

Хроматографирование модельной смеси проводится при следу­ющих условиях: расход элюента—100мкл/мин; объем вводимой дозы — 2 мкл; масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; время измере­ния — 0,4 с; длина волны — 230 нм. Хроматограмма анализа мо­дельной смеси приведена на рис. 53, а основные хроматографические параметры — в табл. 49.

Таблица 49. Основные хроматографические параметры разделения 1,4-бензодиа­зепинов

Вещество Коэффициент емкости, К*

V* — Уо Уо

Селективность а = к2/ к! Степень разделения *К2 “ 1К|
8 Мо,5(1) + Мо,5(2)
2/, |3/2 |4/3 |5/^ 6/5 6/, 2/, 3/2 |4/з 5/4
Гидазепам 1,75 1,39 — 1,67 —
Нитразепам 2,44 1,19 — 1,5
Оксазепам 2,91 1,34 — 1,86
Хлордиазе­ 3,89 1,78 3,9
поксид
Феназепам 6,85 . 1,45
Диазепам 9,95 5,69

Примечание. Ук— объем удерживания,*; мкл; У0 — объем удерживания несорби- руемого вещества (нитрат натрия), мкл; К1 и Кг—коэффициенты емкости первого и второго вещества; Д I — разность времени удерживания разделяемых соседних веществ, мм; о>о,5 — ширина пика на половине высоты, мм.

Контрольная модельная смесь АНБ, АХБ, АБХБ, медазепама и МХБ готовится в растворе подвижной фазы. Для этого:

а) берутся навески АНБ, АХБ, АБХБ, МХБ и медазепама по 30 ± 1 мг;

б) навески переносятся в колбу 50 см , объем доводится до метки, смесь встряхивается до полного растворения и фильтруется; сохраняется при + 4°С.

Хроматографирование модельной смеси проводится при следу­ющих условиях: расход элюента — 100 мкл/мин; объем вводимой

Рис. 53. Хроматограмма модельной смеси 1,4-бензодиазепинов: I — гидазепам;

2 — оксазепам; 3 — нитразепам; 4 — хлордиазепоксид; 5 — феназепам; 6 — ди­азепам; Пр. 1 — неидентифицированная примесь в хлордиазепоксиде; Пр. 2 — неидентифицированная примесь.

«Милихром»; масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; время измерения — 0,3 с; величина вводимой дозы — 2 мкл; X — 230 нм

Рис. 54. Хроматограмма модельной смеси бензофенонов: 1 — АНБ; 2 — АХБ; 3 — АБХБ; 4 — медазепам; 5 — МХБ; Пр. 1, Пр. 3 — неидентифицированные при­меси; Пр. 2 — неидентифицированная примесь в АБХБ. «Милихром-2»; масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; время измерения — 0,4 с; величина вводимой дозы —

2 мкл; X — 220 нм

дозы — 2 мкл; масштаб регистрации —1 0,4 е.о.п.; время, измере­ния — 0,4 с; длина волны — 220 нм. Хроматограмма анализа мо­дельной смеси бензофенонов и медазепама приведена на рис. 54, а основные хроматографические параметры — в табл. 50.

Таблица 50. Основные хроматографические параметры разделения бензофенонов и медазепама

Вещество Коэффи­циент ем­кости (К’) Селекп ГИВНОСТЬ (а) Степень разделения (К.)
2/. 3/2 4/з 5/4 5/1 2/, 3/2 4/з 5/4
АНБ 1,73 2,22 2,62
АХБ 3,85 1,24 1,21
АБХБ 4,77 1,28 1,18
Медазепам 6,09 1,42 2,32
МХБ 8,62 4,98

15.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕДЕЛОВ ОБНАРУ­ЖЕНИЯ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ

Предел обнаружения анализируемого вещества определяется по величине такого количества вещества, которое вы­зывает сигнал, превышающий в 5 раз уровень флюктуационных шумов, который на шкале чувствительности 0,1 е.о.п. (для хрома­тографов «Милихром-2» и «Милихром-4») и 0,4 е.о.п. (для хромато­графа «Милихром») составляет 2 мл. Отсюда минимальное значение сигнала Ьмин*2 мм х 5. Значения пределов обнаружения (Омин, мг) рассчитываются по формуле

с’ — Ьмии-С-дМ

0мин~ НгМ*

где

С — концентрация анализируемого вещества;

Ч — объем вводимой дозы, мкл;

й* — высота пика анализируемого вещества на шкале чувстви­тельности М|, мм;

М — масштаб чувствительности при определении уровня флюк­туационных шумов;

М} — масштаб чувствительности при анализе.

Пределы обнаружения гидазепама, нитразепама, оксазепама, хлордиазепоксида, феназепама, диазепама и медазепама на хро­матографе «Милихром-2» приведены в табл. 51.

Таблица 51. Пределы обнаружения бензодиазепинов

Вещество Предел обнаружения (Смин) • Ю‘б, мг
Гидазепам 6,5
Оксазепам 3,4
Нитразепам 11.1
Хлордиазепоксид 17,8
Феназепам 13,3
Диазепам 15,0
Медазепам* 12,5

* Медазепам определяется в условиях, отличных от остальных бензодиазепинов (см. п. “Бензофеноны4*).

15.6. АНАЛИЗ БИОПРОБ НА СОДЕРЖАНИЕ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНОВ

Сухой экстракт, полученный после профпод­готовки биологического объекта, растворяют в 100 мкл подвижной фазы и 4 мкл вводят в хроматографическую колонку.

15.6.1. Качественный анализ

Идентификация бензодиазепинов и бензофенонов, содержащихся в биопробах, производится следующим образом:

а) сопоставляются время (объемы) удерживания и коэффици­енты емкости определяемого компонента и образцов сравнения (эталонный раствор) индивидуальных бензодиазепинов и бензофе­нонов;

б) сопоставляются УФ-спектры определяемого компонента и об­разцы сравнения (на рис. 55 и 56 приведены УФ-спектры нитра­зепама, хлордиазепоксида, АНБ и АХБ в растворе подвижной фазы);

в) оценивается совпадение значений времени удерживания оп­ределяемого компонента и образца сравнения при добавлении эта­лонного раствора в раствор экстракта из биопробы (концентрация образца сравнения должна быть близка к концентрации определя­емого компонента) (рис. 57);

г) сопоставляются УФ-спектры определяемого компонента и об­разца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спект­ральное отношение.

На рис. 58, 59 приведены примеры хроматограмм экстрактов из мочи, желудка, кишечника, печени, почек, полученных на хро­матографах «Милихром» и «Милихром-2». В экспертном материале обнаружены диазепам, оксазепам, медазепам, МХБ.

15.6.2. Количественный анализ

Для количественного анализа бензодиазепинов и бензофенонов в биопробах можно использовать различные методы, в том числе метод добавки, метод внешнего стандарта, метод внутреннего стан­дарта и т.д.

а) Метод добавки. В соответствии с методом добавки проводят анализ раствора экстракта биопробы и этого же раствора, но с добавкой в него раствора известной концентрации предполагаемого бензодиазепина или бензофенона (эталонного раствора). Анализы растворов «без добавки» и «с добавкой» должны проводиться в одном масштабе регистрации.

Концентрация определяемого вещества (СО в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле

где

Ск — концентрация «добавки» в растворе подвижной фазы;

Ук — объем добавленного эталонного раствора;

VI — объем раствора экстракта с определяемым веществом;

Ъ\ — высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;

Ьи*— высота сигнала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта эталонного раствора.

б) Метод внешнего стандарта. В соответствии с методом внеш­него стандарта и с учетом линейной зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, вслед за анализом раствора экстракта биопробы проводят анализ эталонного раствора иденти­фицируемого вещества. Концентрация эталонного раствора (Ск) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализ эталонного раствора и экстракта био­пробы должен производиться в одном масштабе регистрации.

I————————————— 1 | 1

180 360 190 360 нм

Рис. 55. УФ-спектр: а) нитразепама и б) хлордиазепоксида в диапазоне длин волн 190 — 360 нм. «Милихром-1»; скорость ленты — 30 мм/мин; время измере­ния — 1,2 с

Рис. 56. УФ-спектр: а) АНБ и б) АХБ в диапазоне длин волн 190 — 360 нм. «Милихром-2»; скорость ленты — 30 мм/мин; время измерения — 1,2 с

Рис. 57. Хроматограмма экстракта из мочи пациента Г.: а) без добавки и б) с добавкой в экстракт АБХБ. «Милихром-2»; концентрация эталонного раствора—

0, 025 мг/мл; масштаб регистрации — 0,2 е.о.п.; вводимая доза — 2 мкл; Я — 220 нм; 1,2 — фон мочи; 3 — АБХБ

Рис. 58. Хроматограмма экстракта: а) из содержимого кишечника (образец № 173); б) из почки (образец № 542); в) из пе­чени (образец № 542). «Милихром»; X — 230 нм; а) масштаб регистрации — 0,2 е.о.п.; вводимая доза — 5 мкл; 1 — фон кишечника; 2 — диазепам; 3 — ме­дазепам; 1 — неидентифицированный компонент;

б) масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; вводимая доза — 3 мкл; 1 — фон почки; 2 — нозепам; 3 — диазепам; 4 — АХБ;

в) масштаб регистрации — 0,2 е.о.п.; вводимая доза — 2 мкл; 1 — медазепам; 2 — МХБ

Рис. 59. Хроматограмма экстракта из содержимого желудка (образец № 436); «Милихром-1»; масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; вводимая доза — 4 мкл; X — 230 нм; 1, 2, 3 — фон желудка; 4 — диазепам; 5 — МХБ

Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (СО рассчитывается по формуле

С’~ К ’

где

Ъ\ — высота сигнала определяемого бензодиазепина или бензофе- нона в растворе экстракта биопробы;

Ьк — высота пика вещества эталонного раствора.

в) Метод внутреннего стандарта. В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообъект до пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. В анализе бензодиазепинов в качестве внутренних стандартов рекомендуется использовать любой из анализируемых бензодиазепинов или другие вещества, которые в данных условиях хроматографического разде­ления должны полностью отделяться от других компонентов об­разца, элюировать близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требова­ниям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использо­вать одновременно два и более внутренних стандарта.

Концентрация определяемого вещества (СО рассчитывается по формуле

С — ^вс 1

1 Ьвс ^/вс’

где

Свс — концентрация внутреннего стандарта;

Ъ\ — высота пика (или площадь) определяемого вещества;

Ьвс — высота пика (или площадь) стандарта;

Р^/вс— относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Р|/Вс вычис­ляется по формуле

где

Ь| — высота пика (или площадь) компонента известной концент­рации (калибровочный раствор);

С\ — концентрация калибровочного раствора определяемого ком­понента;

Ьвс — высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;

Свс — концентрация внутреннего стандарта.

Содержание АБХБ в экстрактах из мочи (рис. 57) определялось по методу добавки и по методу внешнего стандарта (концентрация эталонного раствора образца сравнения — 0,025 мг/мл). Концент­рация АБХБ в экстракте из мочи, рассчитанная по методу добавки (рис. 57), составила 0,033 мг/мл, а методом внешнего стандарта — 0,030 мг/мл. В табл. 52 приведены результаты анализа экспертного материала.

Обра­

зец,

Орган Обнаружено Концентрация 1,4-бензодиазе­пина в пробе, мг/мл
1,4-бензодиазепин бензофенон

(после гидролиза)

436 желудок диазепам МХБ 0,060
542 почка медазепам, МХБ и АХБ 0,050
диазепам
АХБ
542 печень оксазепам 0,003
173 кишечник медазепам, МХБ 0,015
диазепам 0,005

В образцах № 542 и 173 определены помимо основного бензо- диазепина — медазепама также и его метаболиты — диазепам (173) и оксазепам (542), что подтверждается анализом гидролизо­ванных экстрактов.

ЛИТЕРАТУРА

1. С1агк Е.С.С. 1$о1а1юп апс1 ЫепИЛсаИоп о( Бги^. Ьопйоп, 1975. Уо1.2.

2. 8сНй1х Н. ВепгосНагершез: А Напс1Ьоок. Зрпп^ег Уег1а$. ВегНл; НеМеШег^; Кеш Уогк, 1982. Р. 277.

3. Богатский А.В., Андронати С.Я., Головенко Н.Я. Транквилизаторы. Киев: «Наукова думка”, 1980.

4. Лощинин А.Н. Газохроматографический анализ производных 1,4-бензодиа­зепина в биологических жидкостях: Автореферат на соискание ученой степени канд.фарм.наук. М., 1980.

5. Изотов Б.Н., Волкова И.В., Андрияко ТБ. Методические указания об оп­ределении хлозепида и нитразепама в трупном материале. М.: М3 СССР, 1986.

6. Химико-токсикологический анализ веществ, вызывающих одурманивание: Методические указания. М.: М3 СССР, 1989.

7. Магпаг А/., ВШег 8.Я.//]оитгЛ о? СЬгоша1о^гарЬу. 1989. Уо1.497. Р.201.

8. А$со1опе К//1оита1 о* СЬгота1о^гарНу. 1980. Уо1.181. Р. 141.

9. Коет^Ьауег М./., Азхеига З.Р., Ш1к>и%ИЬу К.8., СигНв М.А.//3оигпа1 о? СЬгота1о^гарНу. 1987. Уо1. 413. Р. 161.

10. РегсНакЫ Я./., ШШег В.1.ЦАпа1уйса1 СНепшЛгу. 1978. Уо1.50. Р.554.

11. КаХпагу М, СоШЬег% К/Х, Е1уаз А, Ьазсейех Р.Т.ПАла1у$!. 1981. Уо1.106. Р. 1001.

12. Ыоуё 1.В.Г., Рангу /).А//1оита1 о( СНгошаЮ^гарЬу. 1988. Уо1.449. Р.281.

13. Ыоуй ].В.Р.% Раггу />.А.//Доигпа1 о? Апа1уИса1 Тох1со1о^у. 1989. Уо1.13. Р. 163.

14. Мига Р., Р1поп А., РгаШогй Р. е.а.П1 оигпа! о? СНгошаЮ^гарЬу. 1987. Уо1.416. Р. 303.

15. ЗигШ К., 1оНпо /., КИагатЬ 5.//1оигпа1 оГ СЬгота1оггарЬу. 1988. Уо1.425. Р. 435.

16. Коетфауег А/./., СиЯя А/.А//1оита1 о( СНготаЮ^гарЬу. 1988. Уо1.427. Р. 277.

Таблица 53. ВЭЖХ-анализ барбитуратов

Анализиру­емый объект Вид и объем вводимой пробы, я мкл Детектор (предел детектирования (ПД), линейный диапазон и центри­фугирования органиче­ский слой сливается.

4 мл этой фазы упарива­ют досуха. Остаток раст­воряют в 50 мкл мета­нола и 20 мкл вводят в колонку.

Потери при пробоподго- товке не превышают 5%

разбавлении их водой: для мочи — ФБ: 5, 10, 20, 40 и 60 мкг/мл, ГФБ: 0,25, 1, 2, 4 и 8 мкг/мл; для головного мозга — ФБ: 25, 50, 100, 150 и 200 мкг/мл; ГФБ: 10, 20, 40, 60 и 80 мкг/мл. Хро­матографическому ана­лизу биопроб предшест­вует пробоподготовка. Параллельно проводился прямой анализ (без про- боподготовки) водных растворов этих веществ в том же диапазоне кон­центраций. Коэффици­енты корреляции зависи­мости С\ в воде — С» в биопробе: для ФБ — 0,999; для ГФБ —0,998. Коэффициенты регрес­сии для ФБ: аЧ),()77, в-0,022; для ГФБ: а-0,150; в-0,005. Сходимость (п-5) для ФБ— 2,3; 1,4; 0,7% для концентраций 5,0; 20; 60 мкг/мл; для ГФБ—3,6; 2,0; 1,1% для концент­раций 0,25; 2,0; 8,0 мкг/мл.
Фенобар­битал (ФБ) и его мета­болиты; п-гидро- Образец: моча па­циентов невроло­гической клиники, УФ-детектор ЛДфб “5 — 200 мкг/мл, Сорбент— Ультра­сфер ОБ5 (5 мкм) (250×4,6мм); предколонка К 200 мкл мочи добавля­ется 4 мкг ВС (20 мкл рабочего раствора с кон­центрацией 200 мкг/мл), 1 мл насыщенного раст­вора сульфата аммония, Базовые растворы внут­реннего стандарта, ФБ, ГФБ и ФНБ в метаноле с концентрацией 1 мг/мл. Рабочие растворы — из базовых в метаноле; для 5-метил- 5-фенил- гидантоин (раствор в метаноле (3)
1 2 3 4 5 6 Продолж ?ние табл. 53 8
ксиЛено-

бароитал

(ГФБ)

и \-р —Б-

глюкопи-

ранозил-

фено-

оарбитал

(ФНБ)

приняв­ших дозы ФБ 60 — 120 мкг/мл, ц-20 мкл ЛДфнб -2 — 120 мкг/мл, ПД-1 мкг/мл (для всех ве­ществ). Шкала — 0,05 е.о.п. — С,*

(7 — 50мкм) (32×4 мм), ПФ-ацетони- трил —

0,025 М натрийфос- фатный бу- фер

(рН-7,0)

Я-204 нм, Р-1,4мл/мин

Уленты-

0,25см/мин. Удерживание (!Уд,мин) :

ГФБ, ФНБ, ВС, ФБ: 7,0; 9,4; 11,5; 21,6

2 мл этилацетата.

После перемешивания, центрифугирования орга­нический слой деканти­руется, упаривается досу­ха. Сухой остаток раство­ряется в 200 мкл, вводит­ся в хроматограф. Извле­чение ФБ и метаболитов определялось на конт­рольной смеси в бланко­вой моче с содержанием ФБ-50 и 200 мкг/мл; ГФБ и ФНБ-30 и 120 мкг/мл. Степень извлече­ния при пробоподготовке рассчитывается по сопо­ставлению с данными прямого ввода эквивалент­ных количеств в водном растворе к ВС. Среднее значение извлечения со­ставляет: для ФБ — 100,6+0,1 %; для ГФБ— 96,8±0,2%; для ФНБ— 81,1±4,1 %

ФБ — 200 и 50 мкг/мл; для ГФБ — 120 и 30 мкг/мл; для ФНБ—120 и 30 мкг/мл;

для вн.ст. — 200мкг/мл. Контрольные растворы готовятся путем разбавле­ния мочой рабочих ра­створов после упаривания метанола в потоке азота. Контрольные растворы в моче готовились в диапа­зоне концентрации: для ФБ — 5—200 мкг/мл; для ГФБ—2—120 мкг/мл; для ФНБ—2—120 мкг/мл. Анализу растворов пред­шествует пробоподготов- ка. Сходимость анализов для смеси в моче с кон­центрациями: ФБ — 80 мкг/мл, ГФБ и ФНБ — 60 мкг/мл (п-8, соотве­тственно 5; 5,8; 4,7%). Воспроизводимость в те­чение 5 дней — 5,5; 3,0; 5,6%. Калибровочные графики для контрольных растворов ФБ, ГФБ и ФНБ в моче:

Ь. /Ьвс — ^ /Свс. Коэффициент корреля­ции — 0,997

[ 4 мкг (20 мкл рабочего раствора в метаноле с конц. 200 мкг/ мл)
15 барби­туратов Образец: сыворотка крови и слюна до­бровольца, УФ-детектор ДЦ| -20 — 500 нг, ПД|-2,4 нг Сорбент— Лихросорб & 600, модифициро­ванный диме- К 1 мл сыворотки крови или слюны добавляется 3,5 мг внутреннего стан­дарта, 2 мл ацетатного буфера 0,001 М (рН-5,5), Для гексабарбшала контрольные растворы гото­вились в диапазоне 1- 12 мкг/мл. Сходимость для концентрации ВС—амо­барбитал (3,5 мг).

ВС добав­ляется в

Продолжен

(4)

ил табл. 53

1 2 3 4 5 6 7 8
приняв­шего 400 мг гексабар- битала (Г), и больного, принимав­шего бар­битураты регулярно; 4-104 мкл тилхлорсиланом (316×2,8 мм). ПФ—метанол— вода

(25 : 75;

30 : 70;

40 : 60;

50 : 50). Удерживание бароамила (Б) и этаминала натрия (Э) для указан­ных ’ПФ следующее:

Кб — 33,6; 22,9; 9,39; 3,69;

К’- 35,0;

24,3; 9,49; 3,80. Предколонка с силикагелем 3*-60

(63—200 мкм) (500×9 мм).

Я-220 нм

10 мл смеси гексана— эфира—н — пропанола (49:49:2). После переме- 104 мкл .вводят в хрома­тограф.

Степень извлечения гек- сабарбитала и секобарби- тала из водного раствора и из сыворотки составля­ет 90 и 95%. Для фено­барбитала — соответст­венно 70 и 50%

50 мкг/мл — 0,3%; для 5 мкг/мл — 3%; для 0,05 мкг/мл — 15%. Чувствительность мето­дики к гексабарбиталу (коэффициент пропорци­ональности) — К -5,29 мк V сек/мг. Коэффициент корреля­ции этой прямой — 0,99984. Предел опреде­ления для «Г» устанавли­вается как величина сиг­нала, превышающая шум в 3 раза (при надежности 99,7%).

После приема 400 мг «Г’ содержание в сыворотке крови через 6 ч —

160 нг, в слюне через 2,5 ч — 160 нг

сыворотку крови или слюны
Амило-

барбитал

(барбамил),

буто-

барбитал,

цикло-

барбитал,

пенто-

барбитал

(этаминал

№), хино-

барбитал

Образец: кровь пя­ти добро­вольцев, д-200 мкл УФ-детек­тор, шкала 0,01—0,02 е.о.п.;

ПД* 1 мкг/мл; для всех барбитуратов

ЛДпентобарб*» 1 — 200 мкл/мл

Сорбент— Гийерсил 003(5 мкм), (100×5 мм) ПФ: метанол- дигидрофосфат N3 0,1 М (рН-8,5)

(40 : 60) ;

Я-240 нм;

К 100 мкл крови добав­ляется 20 мкл внутрен­него стандарта (раствор в этаноле 25, 61 мкг/мл); до 1 мл разбавить фос­фатным буфером (0,1 М; рН-7,5), затем 5 мл экстрагента — гексан—диэтиловый эфир (50 : 50). После перемешивания, центри­фугирования органиче- Калибровочные растворы готовятся в метаноле и в холостой сыворотке кро­ви с содержанием (мкг/мл):

Са-8,4; Сб-7,5;

Сц-12,9; Сп—10,1;

Сх-8,2

Растворы в холостой кро­ви перед анализом под­вергаются пробоподготов­ке. Сходимость опреде-

ВС—тал-

бутал

(1 метил-

пропил ал-

лилбарби-

туровая

кислота)—

20 мкл

(раствор в

этаноле

25,61

мкг/мл) 1

(5)

1 2 3 4 5 б Продолже

7

пае табл. 53 8
давление — 116 атм;

5 мин;

1уд.пентобарб.»“

6 МИН

ский слой декантируют (4 мл),выпаривают досу­ха. Сухой остаток раство­ряют в 500 мкл ПФ и 200 мкл вводят в хрома­тограф. Извлечение ука­занных барбитуратов рас­считывалось по отноше­нию к внутреннему стан­дарту прямого ввода метанольных раст­воров эквивалентных количеств. Степень из­влечения указанных бар­битуратов из сыворотки крови составляет 94,2 — 99,2% ления хинобарбитала (п-6) для концентраций 4,52 и 47,4 мкг/мл со­ответственно 2,9 и 1,5%. Содержание пентабарби- тала (этаминала Ка) в венозной крови после приема 182 мг через 2 ч— 3,15 мкг/мл; через 8 ч — 2,26 мкг/мл. Содержание циклобар- битала в крови после при­ема 182 мкг через 2 ч — 0,86 мкг/мл; через 8 ч —2,95 мкг/мл
Аллобар- битал (А), Фенобар­битал^), бутабарби- тал (Ба), бутабитал (Би), пен- тобарби- тал (П) Образец: плазма крови ({-25 мкл УФ-детек-

тор

Сорбент —

/4 — Бондапак С|8 (5 мкм) (150×3,9 мм); ПФ—вода— ацегоюлрил — 1,75 М фос­форная кис­лота (798 :

200 : 2) ;

Я-195 нм, Р-0,8мл/мин; время удержи­вания (мин): Барбитал (ВС) — 3,9,

А — 6,3,

Ф — 9,1,

К 0,4 мл плазмы, содер­жащей барбитураты, добавляют 0,2 мл 1н НС1, 4 мл хлороформа. После перемешивания, центри­фугирования 3,5 мл ор­ганического слоя декан­тируют, упаривают до­суха. Сухой остаток рас­творяют в 0,5 мл ПФ и добавляют 0,1 мл вн.ст. После перемешивания 25 мкл смеси вводят в хроматограф. Степень из­влечения указанных бар­битуратов из плазмы оце­нивалась по сравнению с данными анализа этих барбитуратов в ПФ и сос- Базовые растворы в эта­ноле — концентрация в 1 мкг/мл. Рабочие ра­створы готовятся на базо­вых разбавлением ПФ в диапазоне 1—20 мкг/мл. Контрольные растворы— в плазме концентрацией 1, 2.5, 5, 7,5, 10 и 20 мкг/мл. К каждому до­бавляется 1,67 мкг вн.ст. Перед анализом прово­дится пробоподготовка растворов плазмы с бар­битуратами. Калибровоч­ные графики строятся для каждого вещества:

5» / Звс — С» / Свс . Сходимость по барбиту­ратам 3,5—4,5%

ВС—бар­битал с конц. 10 мкг/мл (6)
Продолжение табл. 33

1 2 3 4 5 б 7 8
Ба — 10,5, Би — 12,3, П — 18,9 тавляет для (А) 65%, для (Ф) — 81%, для (Ба) — 73%, для (Би) — 75%, для (П) — 91%
Фенобар­битал (Ф) в смеси с бензона- лом(Б), галоди- фом(Г), карбама- зепином (К) Образец: сыворотка крови че­ловека и морских свинок; 4-5 — 10 мкл УФ-детектор Я-228 нм; ЛД-5—120 мкл/мл; ПД-0,1 мкг/мл Сорбент— Силасорб & 600(5 мкм) (62×2 мм); ПФ—гексан— хлороформ— изопропанол (70 : 22 : 8); Я-228 нм; Р-0,2мл/мин; время удер­живания

({уд.мин):

Ф-1,3,

Б-1,08,

Г-2,8,

К-4,75

К 0,2 мл сыворотки кро­ви добавляется 0,2 мл раствора внутреннего стандарта

(С»н.ст.»20 мкг/мл),

0,3 мл 0,25 н НС1,

2 мл хлороформа. После перемешивания и цент­рифугирования органи­ческий слой сливали, вы­паривали досуха. Сухой остаток растворялся в 20 мкл элюента, и 5—7 мкл этого раствора вводилось в хроматограф.

Для оценки степени из­влечения в 0,2 мл сыво­ротки готовились раство­ры каждого анализируе­мого вещества с концен­трацией 5, 10, 20 мкг/мл (п-10 — каждого). Эк­вивалентные растворы этих веществ с теми же концентрациями, но с до­бавкой вн. стандарта го­товились в растворе хло­роформа.

Степень извлечения для Ф,Б,Г,К составляла: 99+2, 98±3, 90±3, 97±3%

Количественная оценка на основе калибровочных кривых — в координа­тах

Ь* /Ьвс — С\ /Свс.

В бланковой сыворотке готовились растворы каждого из анализируе­мых веществ в диапазоне 2—120 мкг/мл.

Анализ проводился после пробоподготовки

ВС—фена- зепам (раствор в хлоро­форме с концент­рацией 20мкг/мл) (7)
I 2 3 4 5 б 7 8
Бутобар- битал (Б), гексабар* битал, амобарби­тал,секо­барбитал (С) Образец: моча; ц-25 мкл УФ-детектор, 2 насоса для подачи ПФ,

Л -220 нм, ЛД-0,06 —

60 мкг/мл. Масштаб — 0,01 е.о.п. ПДб-1 нг, ПДс-2 нг

Предколонка сополимер- стирол—диви- нилбензола

10 мкм (2×4,6 мм). ПФ| — 0,05М водный раст­вор ацетат­ного буфера.

11 предколонка Аминекс-28 (11 мкм) (5×3,0 мм). ПФп — метанол-ам- миачный буфер ,

4 • 10’3 М (50 : 50). Аналит. ко­лонка—Хро­мосфер С|8 (5 мкм)

(100×3 мм)

Моча после фильтрова­ния через фильтр (1 — 2 мкм) вводится непос­редственно в ЖХ-систе­му. Барбитураты выделя­ются из мочи селектив­ным пробоотборником на потоке, использующем предколоночную техно­логию. На I предколонке происходит сорбция бар­битуратов и других орга­нических составляющих мочи. Неорганические примеси из мочи легко удаляются. Барбитураты с I предколонки в раство­ре ацетатного буфера 2 • 10“ М попадают на II подколонку. После их нейтрализации и десорб­ции барбитураты в потоке метанола — 0,1М ацетатный буфер (50:50) попадают на аналитиче­скую колонку. Степень извлечения оценивалась по сравнению с раствора­ми барбитуратов в ра­створе ПФ (для концен­трации

Сбутобарб.—2,0 МКГ/МЛ И Ссе1со6ар6.-2,5 МКГ/МЛ) И

составляла соответствен­но 95 и 105%

Базовые растворы в ме­таноле с концентрацией 2 мг/мл. Для использова­ния растворы разбавля­лись водным 0,05 М ацетатом Ка (рН-5,0). Контрольные растворы секооарбитала и бутобар- битала в моче готовились в диапазоне концентра­ций 0,06 — 60 мкг/мй. Сходимость результатов анализа секооарбитала и бутобарбитала (п-11) для концентраций С-2 мкг/мл — 3,5 и 2,5%.

Коэффициент корреля­ции — 0,9999

Продолжен ие табл. 33
1 2 3 4 5 б 7 8
Фенобар­битал^) совместно с ацета- минофе- ном, кар- бамазе- пином, фенаце­тином и др. Образец:

моча;

д-20мкл

УФ-детек­

тор

Я-254 нм; ПДф-2 нг

Сорбент— Супелкосил ЬС — СЫ (5 мкм) (150×4,6 мм). ПФ—додецил- сульфат натрия (0,05 М вод­ный р-р) с фосфатным буфером рН-7,0;

Р-1,0мл/мин. Предколонка— силикагель (25—40 мкм) (125×4,6 мм)

Прямой ввод мочи, пред­варительно профильтро­ванной через мембран­ный фильтр (0,45 мкм) Для концентрации фено­барбитала в моче —

28 мкг/мл, сходимость анализа (п-5) составляет

7%

(9)

Вещество Вид и объем Детектор, предел вводимой детектирования

пробы, (ПД), линейный

мкл(ц) диапазон (ЛД),

шкала

Способ подготовки пробы (экс- Способ обработки результатов Использу- Ссылка на

тракция, осаждение, депротеи- (внутренний стандарт (ВС); аб- емый основную

нирование, центрифугирование, солютная градуировка, метод стандарт литературу

прямой ввод пробы) нормализации, количество изме­

рений, погрешность)

Пробоподготовка: к 2 мл плазмы крови добавляет­ся 40 пМоль ВС (бензи- ламин). После депротеи- нирования с 2 мл 2,5% перхлората добавляется 2 М ШОН до получения рН-6,5. Смесь центрифу­гируется при 3000 8» и верхний слой переносит­ся на колонку с Амбер- литом СС-50(9,5х0,4см), предварительно промы­тую 0,2 М натрийфосфат- ным буфером (рН-6,5). Дериватизация: элюент из колонки с Амберлитом упаривается до объема 1 мл в токе N2 при 38°С, и к нему добавляется 0,6 мл флюорескамина в аце­тоне (3 мг на 100 мг). После встряхивания в те­чение 1 мин смесь упа­ривается до 1 мл в токе азота при 38°С, а затем к остатку добавляется: 50 мкл натрийацетатного буфера ‘г*М и 3 мл этилацетата. После упа-

Продолжение табл. 54

I

УФ-детек- тор, чувстви­тельность— 0,02 е.а. (единиц абсорбции); ПДВ плазме»

26 нг/мл; ПДв моче»*

2,5 мкг/мл

Сорбент—

Лихросорб-

100

(250×4 мм);

5 мкм. ПФ:

20 г метано­ла, 800 г во­ды, 160 г аце­тонитрила,

1 г пентан сульфоната и 1 г гептан сульфоната 1Ча;

Р-1,5мл/мин;

Я -205нм;

*УДПЭ “

4,1 мин;

*удвс »

5,9 мин

ривания сухой остаток растворяется в 40 мкл воды и 40 мкл ПФ; 50 мкл вводится в ХК. Сте­пень извлечения всех анализируемых веществ и ВС — 62—83% (п-4); коэффициент вариа­ции —3,9—8,7% Подготовка плазмы: к 0,25 мл плазмы добавля­ется 100 мкл ВС (ацето- бутанола); 0,25 мл смеси: ГО г ШОН и 40 г ШгСОз в 1000 мл Н20,

6 мл смеси н. гексан и диэтиловый эфир (1:1). Смесь перемешивается 30 мин, центрифугаруется 10 мин при 2000 об/мин. Органическая фаза де­кантируется в другую пробирку, содержащую 150 мкл 0,05 М Н28О4. Перемешивается 10 мин и центрифугируется при 2000 об/мин. Органиче­ская фаза удаляется, и Ч—100 мкл вводится в ХК. Подготовка мочи: а) с использованием твердожидкостной экс­тракции. К 1 мл мочи добавляется 75 мкл (С-1 мг/мл) ВС (ацетобу- танола), 1 мл 0,14М ШОН.

Контрольные растворы ВС—аце- (3)

ПЭ в плазме с концент- тобутанол рациями: 500, 250, 100, (10 мг/мл 50 и 25 нг/мл. Готовятся в воде) из рабочего раствора ПЭ—1000 нг/мл в плазме, в свою очередь получае­мого из исходного:

1 мг/мл ПЭ в воде раз­бавляется плазмой до концентрации в плаз­ме 1000 нг/мл.

По калибровочному гра­фику для контрольных растворов в плазме (ана­лизу предшествовала пробоподготовка) опреде­лялись ур-ния регрессии у-0,00015Х+0,008 и ко­эффициент корреляции г-0,9996. Приводятся ре­зультаты анализа ПЭ в’ крови добровольца после приема 100 мг ПЭ через 24 ч (концентра­ция составляет 26 нг/мл) и через 2 ч (концентра­ция ПЭ составляет 340 нг/мл)

Продолжение табл. 54

I

УФ-детек­тор, чувстви­тельность—

0,8×1,6 е.о.п. ПД -60—

80 нг

через эту колонку пропу­скается 300 мкл 0,1 М метанола в НС1. Элюат упаривается досуха при 40°С в токе N2. Сухой остаток растворяется в 100 мкл воды; 20—40мкл вводится в ХК. Подготовка мочи: моча разбавляется водой 1:10 (остальное анало­гично плазме). Коэффи­циент извлечения для ПЭ— 85—88% (п-5). Рассчитывается по сопо­ставлению сигнала ПЭ после пробоподготовки и сигнала ПЭ из водного раствора

Сорбент: , Пробоподготовка для де-

1) Партисил риватизации: к 5 мл мочи

(260×0,8 мм); добавляется 20 мкл ВС,

2) Силасорб 10% МН4ОН до рН-

600 9—10 и 5 мл бензола. По-

(50×3,5 мм); еле перемешивания и

ПФ—гексан- центрифугирования бен-

ацетон-этил- зольная фаза декантиру-

ацетат ется и упаривается до 0,5

(40:8:2); мл. К остатку добавляется

Р-50, 100 1—2 капли бензола и 0,5

мкл/мин; мл аммиачного реактива

Я-330 нм N1. Время дериватиза-

продуктов ции — 30 мин. Органи-

дериватизации ческая фаза сливается,

упаривается досуха в токе воздуха комнатной тем­

ные количества рабочих 1 мл растворов. Стандартные 0,03 М растворы — 10—500 НО до нг/мл ПЭ. рН-3,

Определялась воспроиз- а затем водимость для смесей ПЭ разбавля- с концентрациями 20, ется водой 100 и 500 нг/мл. Коэф- 1:100). фициент вариации — Этот ра- 1,8—8%. Концентрация створ ус- ПЭ в моче добровольца тойчив в после приема 120 мг ПЭ течение 5 через 8 ч — 174 нг/мл, дней в хо- в крови через 24 ч — лодильни- 35 нг/мл ке

Калибровочные растворы ВС—ана- (5) эфедрина и эфедрона го- прилин товятся в моче (с после- (20 мкг) дующей пробоподготов- кой) в диапазоне концен­траций 1—20 мкг. Гра­дуировочная зависимость в координатах 3» / Зет — предколонка (30×2,1мм) Се (10 мкм), аналитическая колонка (100×2,1 мм) Се (3 мкм); ПФ—700 мл; КН2РО4 (0,01 М)+

300 мл ацето-

нитрила+100 мкл диметила­мина; Р-0,3 мл/мин;

X-242 нм 1 мл контрольного ра­створа бланковой сыво­ротки или сыворотки па­циента (совместно с 200 мкл раствора ВС с кон­центрацией 5 мкг/мл) пропускается через ко­лонку с твердофазным сорбентом (С|8, 40 мкм), предварительно кондици­онированную. Гидрофоб­ные и гидрофильные примеси сыворотки уда­ляются 3 мл смеси: дистил­лированная вода—мета­нол—ацетонитрил (2:3:3), после чего колонка ваку- умируется в течение 2 мин при 250 мм рт.ст., а накопленные бензодиазе- пины извлекаются 400 мкл вышеуказанной сме­си. Элюат’разбавляется 1 мл дистиллированной во­ды, перемешивается; 50 мкл вводится в хроматог-

Базовые растворы бензо- ВС—флу- (7) диазепинов в метаноле— зепам 1 мг/мл. Рабочие раство- (С-1000 ры готовятся из базовых нг/мл) в в бланковой сыворотке в смеси диапазоне концентраций вода—

0,05—2 мкг/мл. Конт- метанол— рольные растворы анали- ацетонит- зируемых компонентов в рил бланковой сыворотке с (2:3:3) концентрациями: а) по 500 нг/мл; б) по 100 нг/мл (с последующей пробоподготовкой). Сте­пень извлечения оцени­валась по сопоставлению результатов анализа вод­ных растворов указанных веществ и экстрактов и составляла для двух зна­чений концентраций —

50 и 500 нг/мл — 97 и 107%. Воспроизводи­мость анализа С2; аналитическая колонка (300×4,6 мм). ц -Бондапак (5 мкм). ПФ- градиент: ацетонитрил (А)-фосфат­ный буфер (Ф) (рН-5,4). Программа:

А Ф 1, мин 38 62 0 38 62 15

К 50 мкл биологической жидкости добавляется 500 мкл ВС и 300 мкл смеси: ацетонитрил — 0,1 М КН2Р04 (10:90), рН-9. Смесь пропускают через предколонку, кото­рая потом промывается 1 мл смеси: ацетонит­рил — 0,1 М КН2РО4

Градуировочные графики ВС-пра- (14)

для всех компонентов зепам строились в координатах Ь* / Ьвс — С{ / Свс •

Сходимость анализа: для диазепама — 3,8%; для оксазепама — 6,5% при концентрации

1 мг/л. Воспроизводи­мость (день ото дня): для диазепама—5%; для оксазепама—14,2%; степень извлечения 92—104% и от концент­рации не зависит

Продолжение табл. 55

УФ-детектор; шкала — 0,005 е.а. ЛД-200нг/мл; ПД-10нг/мл;

УФ-детектор; шкала —1,0; 0,25;

0,125 е.а.; ДЦ-2 — 200 мкг/мл; ПД-2 мкг/мл

70 30 22 70 30 40 38 62 45 Р-0,7 мл/мин Время анали­за—40 мин

Сорбент: Зорбакс ОДЗ (5 мкм) (150×4,6 мм) ПФ—ацегонит- рил-фосфат- ный буфер (2:3). Буфер: 0,6 М КН2РО4 и 14,7 М Н3РО4 (до рН-3);

Р-1 мл/мин;

А-221 нм; 1уд-6,2 мин

Сорбент: предколонка (15×3,2мм)— ОДЗ (5 мкм); аналитическая колонка (250×1 мм). Адсорбосфер ОДЗ (5 мкм)

К 200 мкл плазмы добав­ляется 80 мкл раствора ВС (1 мкг/мл триазалона в ацетонитриле), 1 мл 0,01 М КаОН и 5 мл ди- этилового эфира. Смесь встряхивается 15 мин, центрифугируется при 1500^ 00 мин). Органи­ческий слой удаляется и упаривается досуха в токе азота при 40еС. Сухой ос­таток растворяется в 70 мкл ПФ, и 25 мкл вво­дится в хроматограф

Прямой ввод пробы. 200 мкл сыворотки или мочи вводится на предколонку, которая промывается ПФ

(1) , удаляя экзогенные и эндогенные составляю­щие биопробы. Накоп­ленные на предколонке примеси диазепама и его

В плазму добавлялось ВС—три- (15) 10—200 нг/мл Н, прово- азалон дилась совместная с ВС (С-1 профподготовка. Градуи- мкг/мл) ровочные графики в ко- в ацето­ординатах нитриле

м / Свс — Ь| / Ьвс обрабатывались методом наименьших квадратов.

Определено уравнение регрессии, коэффициент корреляции (п-21) —

0,999. Сходимость ре­зультатов анализа (п-7) не превышала 3%. Вос­производимость в течение 5 дней не превышала 5%.

Степень извлечения Н для С -20 нг/мл и 60 нг/мл составляет 98% при погрешности bgcolor=white>НР-101

ОУ-Ю1 100%-ный диметил — полисилоксан неполярная производные аминокис­лот, масла НР-5 ОУ-73

ЗЕ-52

ЗЕ-54

5%-ный дифенил-, 95%-ный диметил — полисилоксан условно

неполярная

метиловые эфиры жир­ных кислот, алкалоиды, лекарственные вещества НР-17 ОУ-17 50%-ный фенил-, 50%-ный метил- полисилоксан промежуточ­

ная

стероиды, гликоли, пестициды НР-РРАР ОУ-351 полиэтиленгликоль

модифицированный

полярная кислоты, спирты, альде­гиды, кетоны, нитрилы, акрилаты НР-20М карбо-

вакс

20М

полиэтиленгликоль полярная свободные кислоты, спирты, эфиры, лету­чие масла, гликоли, растворители

Ввод пробы может быть осуществлен в обычном варианте «с разделением потока» (зрШ), со сбросом избытка объема пробы, например в отношении 1:40, а также в варианте «запаздывающего разделения потока» (зрШ/зрНИезз). Раствор в хлороформе, метаноле или гексане объемом 0,5 — 0,8 мкл вводится в «холодную» колонку (температура 50 — 75°С), где конденсируется и затем быстро ис­паряется при нагревании колонки, целиком оставаясь в хроматог­рафической системе. Разделение потока газа-носителя автоматиче­ски включается через заданный интервал времени (от 0,3 до 2 мин) для очистки системы ввода от паров растворителя. При этом способе ввода вся проба целиком остается в колонке, что особенно важно при анализе низких концентраций.

16.1.4. Устройство и принцип работы МСД

На рис. 60 представлена функциональная схема ГХ/МСД/ЭВМ- системы. Анализируемое соединение из колонки хроматографа через

Рис. 60. Функциональная схема ГХ/МСД/ЭВМ-системы

соединительное устройство (интерфейс) попадает в МСД, который состоит из трех функциональных блоков, помещенных в вакууми- рованную камеру (10~5 — Ю’бторр). Низкое давление поддержива­ется с помощью механического форвакуумного (до 0,3 торр) и масляного диффузионного высоковакуумного насоса.

Интерфейс. Основная функция интерфейса, соединяю­щего газовый хроматограф и МСД, состоит в создании градиента давления от почти атмосферного на выходе из капиллярной колонки до высокого вакуума в МСД. Интерфейс НР-5890/5971 относится к группе прямого ввода, обеспечивающей перенос всего объема пробы из колонки в камеру ионного источника. В интерфейсе поддерживается температура 280°С независимо от температуры колонки.

Ионный источник. В ионном источнике образуется поток электронов, вызывающих ионизацию нейтральных молекул пробы. Энергия электронов 70 эв достаточна для ионизации боль­шинства органических молекул: образования возбужденного моле­кулярного иона и его дальнейшей фрагментации. Возбужденный молекулярный ион М+* распадается мономолекулярно с отщепле­нием нейтральных частиц (радикалов или молекул) и образованием различных осколочных ионов. Наиболее вероятный путь распада приводит к появлению наиболее интенсивной полосы в масс-спектре, отвечающей «базовому» иону. Среди остальных фрагментарных ионов аналитическое значение имеют «характеристические», свойственные данному соединению или группе соединений. Молекулярный ион устойчивых к электронному удару молекул (например, с аромати­ческой структурой) представлен в масс-спектре интенсивной поло­сой, в то время как в спектре нестабильных структур, склонных к фрагментации, он может быть малоинтенсивным или отсутство­вать.

Процессы, протекающие в ионном источнике:

— образование молекулярного иона

М+е (М )*+2е,

(М*)* — М + Е;

— образование фрагментарных ионов:

— потеря радикала АВСТ. — А + ВС;,

АВС — АВ- + С ;

— потеря нейтральной молекулы АВС — АВ + С;

— перегруппировка

АВС АС + В*.

Анализатор масс. Образовавшиеся ионы с помощью си­стемы фокусирующих линз направляются далее в анализатор масс, или фильтр масс, где происходит их разделение по величине от­ношения массы к заряду (т/г) или, поскольку в основном обра­зуются однозарядные ионы, по величине массы. В МСД это система из четырех параллельных, симметрично расположенных гипербо­лических стержней (квадруполь), во внутреннем пространстве ко­торых вдоль долевой оси движется поток ионов. При этом на квадруполь наложено постоянное электрическое поле, в котором все ионы достигают выхода из анализатора. Наложением перемен­ного высокочастотного напряжения последовательно создаются ус­ловия, благоприятные для прохождения ионов только одной массы. Последовательно фильтруя ионы по величине массы, анализатор осуществляет сканирование всех ионов в заданном интервале масс.

Детектор. Ионы определенной массы, выделенные из общего ионного потока, достигают детектора (фотоумножителя) и регист­рируются. Выходные сигналы подаются на ЭВМ, где соответству­ющим образом обрабатываются.

16.1.5. Станция управления и обработки данных

Работа всей хромато-масс-спектральной системы обеспечивается компьютером, основные функции которого:

— настройка МСД по собственному стандарту (перфтортрибу- тиламину);

— установка и поддержание заданного режима работы всей системы;

— первичная обработка сигналов, принятых от МСД, и пред­ставление их в виде, удобном для исследователя (хроматограмма, масс-спектр);

— осуществление операций с первичной информацией для по­лучения производной информации: вычитание фона, сравнение

ПРОБА БИОЖИДКОСТИ

т

Добавление внутреннего стандарта Настаивание 15 — 60 мин

1

Экстракция

Центрифугирование *

ЭКСТРАКТ

т

Очистка (экстракция, хроматография)

Концентрирование (упаривание, вымораживание)

Дериватизация

Упаривание

Реконструирование

Добавление хроматографического внутреннего стандарта

А_____ :

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ПРОБА ГХ/МС

масс-спектров с библиотечными, интегрирование, построение ка­либровочного графика и др.

Задачи химико-токсикологического анализа диктуют необходимость определения нанограммовых количеств ком­понентов на фоне эндогенных веществ биосубстратов, что выдвигает строгие требования к проведению стадии профподготовки:

— возможно более полное извлечение компонента и (или) его метаболитов из биосубстратов;

— минимальное извлечение эндогенных веществ, особенно бел­ков и липидов;

— минимизация потери анализируемых компонентов;

— предупреждение загрязнений пробы примесями растворителя, материала посуды, пробок, прокладок и др.

Как следствие этих требований, необходимо прежде всего со­блюдение высокого уровня техники ручных операций и особой тщательности при выполнении всех процедур.

16.2.1. Выделение (изолирование) анализируемых веществ

Извлечение анализируемого соединения (АН) после гидролиза осуществляется обычными методами: жидкость-жидкостной экстра­кцией (ЖЖЭ) и твердофазной экстракцией (ТФЭ). Последний позволяет добиться лучшего отделения эндогенных соединений, что особенно важно в отношении белков и липидов, присутствие ко­торых в аналитической пробе не только искажает результаты ана­лиза, но и негативно влияет на свойства хроматографической си­стемы в целом. Другим преимуществом ТФЭ является стабилизация пробы, так как после удаления матрицы вещества не подвергаются гидролитическому или микробному воздействию. На схеме 30 пред­ставлена последовательность операций ТФЭ-изолирования кислых, основных и нейтральных лекарственных веществ для ГХ/МС-ана- лиза.

Метод ЖЖЭ широко применяется для подготовки к ГХ/МС- анализу. Являясь в достаточной степени селективным, он позволяет провести фракционирование смеси часто в одной экстракции, а добавление последовательных стадий обратной экстракции позво­ляет в значительной мере избавиться от соэкстрактивных эндоген­ных соединений. Соэкстракция различных частиц и молекул яв­ляется самым существенным недостатком ЖЖЭ как подготовки к ГХ/МС-определению и является предметом особого внимания на этой стадии. В табл. 58 приведены примеры использования ЖЖЭ для изолирования некоторых соединений.

Изолирование кислых, нейтральных и основных веществ методом твердофазной экстракции

СОРБЕНТ* с привитой группой С-18

————-

КОНДИЦИОНИРОВАНИЕ

I

СОРБЦИЯ

ПРОМЫВКА

I

ВЫСУШИВАНИЕ

ПРОМЫВКА

I

ВЫСУШИВАНИЕ

ЭЛЮИРОВАНИЕ КИСЛЫХ И НЕЙТРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

\

ЭЛЮИРОВАНИЕ ОСНОВНЫХ ВЕЩЕСТВ

I

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ объединенных элюатов

I

РЕКОНСТРУИРОВАНИЕ

последовательно 2 мл метанола и 2 мл фосфатного буфера рН 6

2 мл плазмы и 6 мл буфера скорость 1,5 мл/мин

1 мл фосфатного буфера

с 200 мкл метанола,

затем 1 мл 1 М уксусной кислоты

15 мин под вакуумом

1 мл гексана

1 мин под вакуумом

4 мл метиленхлорида скорость 1,7 мл/мин

2 мл этилацетат +33% гидроокись аммония (98:2) скорость 0,6 мл7мин

4 мин при 40°С под слабым током азота, затем добавить

2 капли 2 М уксусной кислоты в этилацетате, упарить досуха при 40°С под слабым током азота

в 100 мкл раствора

0,2% диэтиламина в этилацетате

ГХ/МС АНАЛИЗ

* Типа БОНД-ЭЛЮТ. В РФ имеются в коммерческой продаже под маркой «ДИАПАК»

Для анализа растворов менее 10 нг/мл даже при минимальном объеме экстрагента 500 мкл экстракт нуждается в обогащении, концентрировании. В большинстве реальных случаев объем экс­трагента сравним с объемом первичной пробы, и, таким образом, концентрирование является непременной стадией пробоподготовки для большинства ЖЖЭ- и многих ТФЭ-экстрактов. Избежать кон­центрирования удается лишь при содержании вещества, превыша­ющем 100 нг/мл, и объеме экстрагента не более 500 мкл (меньшие объемы неприменимы из-за летучести).

Концентрирование обычно проводится методом упаривания до­суха или до 10 — 50 мкл при 40 — 60°С под слабым током азота или очищенного воздуха. Однако даже при этих условиях многие вещества, за исключением веществ с высоким молекулярным весом (стероидов), теряются.

Для предупреждения потерь летучих наркотических соединений (например, амфетаминов) их переводят в соли добавлением в экстракт нескольких капель кислоты или вводят в упариваемый раствор 10 — 20 мкл высококипящих органических соединений, на­пример диметилформамида.

Чтобы не подвергать экстракт длительному тепловому воздей­ствию, экстрагент должен быть по возможности легколетучим и небольшого объема.

Заключительным этапом перед ГХ/МС-анализом является ре­конструирование сухого экстракта с помощью подходящего орга­нического растворителя: метанола, этанола, хлороформа, гексана и др. Хроматографический внутренний стандарт добавляется к веществу на этой стадии в составе реконструирующего раствора. Объем раствора 25 — 100 мкл позволяет сконцентрировать пробу в 40 — 10 раз при исходном объеме биожидкости 1 мл.

Реконструирование проводится непосредственно перед вводом аналитической пробы в инжектор хромато-масс-спектрометра.

16.2.3. Дериватизация

При анализе малолетучих и полярных соединений методом газовой хроматографии необходима дериватизация. При этом не только исключаются потери веществ из-за низкой летучести и сорбции, но и улучшаются характеристики анализа за счет более точного определения площадей пиков, форма которых становится более симметричной, и повышения чувствительности определения.

Функционально это процесс преобразования полярных групп (например, СООН, ОН, ЫНг и ЫН) в неполярные без затрагивания основной структуры молекулы.

В качестве предшественника хромато-масс-спектрального ана­лиза наиболее часто применяют следующие типы реакций:

1. Получение метиловых эфиров органических кислот по реак­ции с диазометаном:

К — СООНК — СООСНз.

2. Получение триметилсилилпроизводных с силилирующими агентами, замещающими активный водород ОН, ]ЧН2 и ЫН групп:

К — ОНК — О — 81 (СНз) з (К — ОТМС)

К — Ш2 -*К. — N — [ЗИСНз)з]2 (К — Ы(ТМС)2).

3. Получение трифторацилпроизводных с фторалкилангидрида- ми кислот или фторациламидами, реагирующими с активным во­дородом ОН, ЫНг и ЫН групп:

К — ОН-^К — О — СО — СРз (К — ОТФА)

К — ЫН2-^К — ЖСО — СРз)2 (К — Ы(ТФА)2).

4. Получение ацетилпроизводных по реакции с уксусным ан­гидридом в безводном растворителе (пиридине):

СНз — СО.

К — ОН 4- О —► К — О — СОСНз.

СНз — СО ^

5. Получение смешанных производных для веществ с различ­ными функциональными группами: например, в молекуле 11-нор- 9-карбокси-тетрагидроканнабинола метилируют СООН-группу и си- лилируют ОН-группу; в молекуле фенолалкиламинов силилируют фенольный гидроксил и ацилируют аминогруппу.

Наиболее употребляемые агенты силилирования:

Ы,О-бис (триметилсилил)-ацетамид (БСА),

Ы,О-бис (триметилсилил)-трифторацетамид (БСТФА),

Ы-метил (К-триметилсилил)-трифторацетамид (МСТФА) и ацилырования:

Ы-метил-бис (трифторацетамид) (МБТФА), трифторуксусный ангидрид (ТФАА), гептафтормасляный ангидрид (ГФМА), пентафторпропионовый ангидрид (ПФПА).

Одна и та же полярная группа может быть преобразована с помощью различных агентов дериватизации. Так, гидроксил опи­атов, экстрагированных из мочи,— морфина, кодеина и налорфина (внутренний стандарт)— может быть переведен в неполярную груп­пу по реакциям перфторэтерификации (с ПФПА или ГФМА), трифторацетилирования (с МБТФА), силилирования (с БСТФА/1 % триметилхлорсилана) или ацетилирования (с уксусным ангидридом в безводном пиридине). Выбор реакции дериватизации имеет важное значение для количественного определения (81М) и основан на следующих основных критериях:

— хорошее разделение дериватов на хроматограмме;

— наличие интенсивных пиков в масс-спектре, обеспечивающих хорошую чувствительность;

— стабильность деривата во времени;

— отсутствие расщепления пиков дериватов на хроматограмме.

Руководствуясь этими критериями, рекомендуется применять для смеси опиатов два реагента: БСТФА с 1 % триметилхлорсилана или уксусный ангидрид в пиридине. ПФПА и ГФМА образуют дериваты, обладающие «плохим» масс-спектром: вторичные и тре­тичные ионы имеют низкую интенсивность. Трифторацетилирова- ние приводит к расщеплению пика налорфина (моно- и ди-ТФА- налорфин) с изменяющимся во времени количественным соотно­шением и, кроме того, образует нестабильный дериват морфина:

3, 6-ди-ТФ А-морфин.

Таблица 57. Групповые ионы смешанных дериватов фенолалкиламинов

Фенолалкиламин Ы—ТФА— ОТМС Фенолалкиламин N—ТФА— ОТМС
М+ в+ М+ в+
п-Ги^роксиамфетамин 319 179 п-Гидроксинорэфедрин 417 267
Тирамин 305 179 п-Гидроксиэфедрин 421 267
Фоледрин 333 179 Октопамин 393 267

Соединения с двойной функцией могут быть дериватизованы по- разному (фенольный гидроксил и аминогруппа фенолалкиламинов):

— силилированием обеих функциональных групп с образованием ЫТМС — ОТМС или Ы(ТМС)2— ОТМС-производных;

— трифторацилированием с образованием 1ЧТФА — ОТФА или Ы(ТФА)2— ОТФА^производных;

— силилированием гидроксигруппы с последующим актирова­нием аминогруппы и образованием ЫТФА — ОТМС-производных.

Выбор того или иного варианта дериватизации определяется задачей ГХ/МС-анализа. Так, при групповом анализе фенолалкила­минов предпочтительным оказывается третий вариант дериватиза­ции, поскольку он ведет к появлению общего, группового иона т/г\\19 или 267 (табл. 57).

Одна и та же функциональная полярная группа реагирует в различной степени в зависимости от ее положения в молекуле: гидроксил фенольный, алкильный и аллильный проявляют разную активность по отношению к некоторым агентам дериватизации (МБТФА). Стерические затруднения могут приводить к полной остановке дериватизации, например, в 14-этил- или 14-бутилзаме- щенных вторичных аминах.

Перед ГХ/МС-анализом необходимо удалить избыток фторсо­держащих ангидридов (ТФАА и др.), которые негативно влияют на хроматографическую систему. Силилирующие агенты обычно вводят в колонку в составе дериватизованной смеси, однако их избыток ухудшает рабочие характеристики МСД, загрязняя метал­лические поверхности.

Примеры приведены в табл. 58.

Продолжение табл. Я 6

Плазма, 9,6 толуол:гептан:
моча изоамиловый спирт
(2 мл) (70:20:10), 200 мкл
Плазма, 7,0 хлороформ: изопропа­
моча нол* (9:1),
(1 мл) 15 мл
Плазма, 9,6 метил-трет-бутило-
моча вый эфир:изопропа-
(1 мл) нол (9:1), 1 мл
Моча 9,6 хлорбутан*
(1 мл) (5 мл)
Моча 9,6 дихлорметан*
(1 мл) (5 мл)
Моча (гидро­ 9,3 хлороформ:изопропа-
лиз.) (1 мл) нол (9:1), 5 мл
Плазма, 9,6 толуол:гептан:
моча изоамиловый спирт
(1 мл) (70:20:10), 1 мл
Моча, 9,6 гексан*
плазма (1 мл) (5 мл)
Моча, 11,8 б\гтилхлорид:метанол
плазма (гидролиз.) (1 мл) (9:1), 2 мл

ДМФА—ДПА (50 мкл),

30 сек на пламени

0,5%-ный сульфат палладия и борогидрид натрия по 5 мл, Iе комн.,

20 мин

Уксусный ангидрид в безводном пиридине (1:1), 100 мкл, 60вС, 15 мин

ТФАА (100 мкл), 70°С, 10 мин или БСТФА (100 мкл), 60вС, 1 час

БСТФА+1 % ТМХС (40 мкл), 70°С, 1 час

Список3 соУКПрааР“й:М ги^олГ 1 „ли ^а, ^ТФА —

ГФМА — гептафтормасляный ангидрид, ДМФА — диметилформамид, ДПА — ди-н-пропил ацеталь,

(трифторацетамид), ТМХС — триметилхлорсилаи, ТФАА — трифторуксусный ангидрид.

От качества проведения всех операций пробоподготовки в зна­чительной мере зависят результаты ГХ/МС-анализа.

Для контроля этой стадии в состав серии анализируемых проб обязательно включают холостые образцы биожидкости, не содер­жащие лекарственного вещества, которые подвергаются всем опе­рациям аналогично исследуемой пробе. Холостая проба показывает собственный фон биожидкости и контролирует степень очистки от эндогенных компонентов, а также возможные загрязнения из рас­творителя и прочих реактивов («реактивная ошибка»), материала пробок, прокладок, посуды и т.п. Эти эндогенные и экзогенные соединения образуют фон и в некоторых случаях дают на хрома­тограмме интенсивные пики, сравнимые с анализируемыми.

В табл. 59 приведены масс-спектры наиболее часто встречаю­щихся фоновых компонентов.

Таблица 59. Масс-спектры фоновых компонентов (массовые числа указаны в порядке возрастания интенсивности)

Соединение т/г
Пальмитиновая кислота 43, 74, 55, 129, 213, 256, 171
Стеариновая кислота 43, 74, 129» 284, 185, 241, 256
Олеиновая кислота 55, 69, 81,95, 111, 129, 264
Холестерин 386, 368, 353, 301, 275
Холестадиен 368, 147, 353, 260
Кофеин 194, 109, 82, 67, 55, 137
Теобромин 180, 55, 66, 109, 137
Никотин 84, 133, 42, 162, 161, 105, 77
Котинин (метаболит никотина) 98, 176, 118
Дибутилфталат 149, 86, 57, 223

16.3. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ХРОМАТО- МАСС-СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

16.3.1. Условия анализа

В зависимости от области применения условия и схема ГХ/МС- анализа изменяются.

Качественный анализ решает следующие задачи:

— идентификация неизвестного соединения;

— подтверждение после скрининга;

— обнаружение метаболитов.

Условия и схема анализа:

— ввод пробы обычно в режиме разделения потока;

— получение хроматограммы в универсальном режиме;

— регистрация масс-спектров в режиме сканирования;

— использование для идентификации библиотек программного обеспечения;

— логический анализ масс-спектров для подтверждения (уста­новления) структуры;

— получение ионных (фрагментарных) хроматограмм для целе­вого поиска вещества с известным масс-спектром. Количественный анализ осуществляется при следующих усло­виях:

— ввод пробы без разделения потока или в режиме «запазды­вающего разделения потока» (зрШ/зрНЙезз);

— условия хроматографирования подобраны оптимально для ана­лизируемого соединения или группы соединений;

— регистрация масс-спектра в режиме детектирования отдель­ных ионов, селективного ионного мониторинга (51М);

— выделение ионных хроматограмм («количественного» и под­тверждающих ионов);

-г- определение площадей пиков (интегрирование);

— построение калибровочного графика;

— расчет содержания анализируемого компонента в «неизвест­ной» пробе.

Для количественного определения необходимо использование внутреннего стандарта и серии калибровочных растворов.

у’

16.3.2. Некоторые нежелательные процессы хроматографическо­го и масс-спектрального определения

В целях использования всех возможностей хромато-масс-спек- трального метода для получения стабильных и достоверных ре­зультатов высокой точности необходимо избежать нежелательных побочных процессов, которые могут идти при хроматографировании или в масс-спектрометре. Эти процессы приводят к потере вещества или его трансформации, что затрудняет или искажает как иден­тификацию, так и количественное измерение.

Для лекарственных и токсических веществ наиболее часто встре­чаются следующие:

— термическое разложение в инжекторе или в колонке: декар- боксилирование кислот; деацетилирование диацетилморфина (герои­на), в процессе которого катализатором являются металлы (никель); разложение 3-гидроксибензодиазепинового кольца (оксазепам, лора­зепам, темазепам); разложение хлордиазепоксида и его метаболита, причем в двух последних примерах регистрация масс-спектра ведется для воспроизводимо образующихся стабильных продуктов реакции;

— адсорбция полярных соединений в инжекторе и в колонке (морфина, барбитуратов и многих других);

— потери веществ из-за недостаточной летучести или непра­вильно подобранных условий хроматографического анализа.

16.3.3. Внутренний стандарт

Получение точных результатов при количественном ГХ/МС- анализе зависит от многих факторов, которые трудно контролиро­вать без применения внутреннего стандарта (ВС).

Хроматографический внутренний стандарт (ВСГХ) добавляется в аналитическую пробу непосредственно перед вводом в хроматог­раф и обычно входит в состав реконструирующего раствора. Кон­центрация ВСГХ в растворе должна быть сопоставима с концент­рацией анализируемого соединения. В качестве ВСГХ могут быть использованы вещества широкого профиля, обладающие хорошими хроматографическими свойствами: достаточной летучестью, ста­бильностью, временем выхода, близким времени выхода анализи­руемого компонента, и симметричным пиком на хроматограмме. Внутренний стандарт и анализируемое вещество не должны пере­крываться, в противном случае они должны иметь различный набор интенсивных линий в масс-спектрах, по которым осуществляются количественное определение и идентификация.

Внутренний стандарт, позволяющий контролировать весь про­цесс пробоподготовки и анализа, добавляется к аликвоте биожид­кости, отобранной для гидролиза или изолирования, и подвергается всем операциям вместе с анализируемым вещество^. В идеальном случае ВС должен вести себя на всех стадиях анализа подобно анализируемому соединению, отличаясь лишь по виду масс-спектра. В этом случае количественные соотношения остаются постоянными на всех этапах, что обеспечивает точные и воспроизводимые ре­зультаты. В наибольшей степени этим требованиям удовлетворяют аналоги, меченные стабильными изотопами, в частности дейтери- рованные соединения. Последние, как правило, и используются в ГХ/МС-анализе наркотических соединений.

При отсутствии дейтерированногО аналога можно воспользовать­ся родственным соединением, изомером или гомологом.

Точное и строго одинаковое количество ВС добавляется ко всем анализируемым растворам: «холостым», калибровочным и неизве­стным. Для расчета оптимального содержания ВС в аналитической пробе С (ВС) можно воспользоваться соотношением

С(АНминим) : С(ВС)=С(ВС) : С(АНмаксим)»

ще С(АНминим) и С (АН максим)—минимальная и максимальная концентрация анализируемого компонента в аналитической пробе, что для интервала 1 — 1000 нг/мкл соответствует примерно 40 нг/мкл.

16.3.4. Приготовление калибровочных растворов

Область концентраций лекарственных и токсических соединений в организме (в частности, биожидкостях) изменяется в широких пределах. Диапазон 1,0 нг/мл — 10 мкг/мл в значительной степени отражает реальные величины, расширяясь вместе с тем до пико­граммов/мл в некоторых случаях анализа и до миллиграмма/мл при отравлении, например, сверхдозами наркотиков.

Калибровочные растворы готовят для диапазона концентраций в соответствии с задачами анализа. Как правило, диапазон охва­тывает два порядка, но в случае нелинейного калибровочного гра­фика может быть разделен на два более узких, в пределах которых линейность сохраняется.

В табл. 60 дается один из вариантов приготовления калибро­вочных растворов для диапазона 10 нг/мл — 10 мкг/мл.

Таблица 60. Приготовление калибровочных растворов

bgcolor=white>

п/п

Конц-ция

эталон­

ного

Приготовление* рабочего раствора метчика Конц-ция

метчика

Смет

Состав** калибровочного р-ра Конц-

ция***

в

р-ра

Сэтал

мг/мл

мкг/мл Скал аналитич.

пробе

Сгх

АН

нг/мкл

Уэтал

МЛ

Уобщ

МЛ

вс

нг/мл

АН

нг/мл

АН

мкг/мл

1 0,01 0,25 5 0,5 800 10 0,5
2 0,01 0,5 5 1,0 800 20 1,0
3 0,01 1,25 5 2,5 800 50 2,5
4 0,01 2,5 5′ 5,0 800 100 5,0
5 0,1 0,5 5 10,0 800 200 10,0
6 0,1 1,25 5 25,0 800 500 25,0
7 0,1 2,5 5 50,0 800 1000 1,0 50,0
8 1,0 0,35 5 70,0 800 1,4 70,0
9 1,0 0,5 5 100,0 800 2,0 100,0
10 1,0 1,25 5 250,0 800 5,0 250,0
11 1,0 2,5 5 500,0 800 10,0 500,0
Холостая

проба

5 800 0 0

* Рабочий раствор метчика готовится на метаноле, этаноле или другом подходящем растворителе общего объема 5 (или более) мл.

** 100 мкл метчика и 100 мкл рабочего раствора ВС добавляют к “стандартной* биожидкости при общем объеме 5 мл.

*** Рассчитана для объема реконструирующего раствора 100 мкл и объема пробы биожидкости 5 мл.

Растворы готовят в следующей последовательности:

— эталонный раствор анализируемого соединения 1 мг/мл с по­следующим разведением до 0,1 и 0,01 мг/мл;

— основной раствор ВС 1 мг/мл;

— серия метчиков (рабочих растворов) (табл. 60);

— рабочий раствор ВС разведением основного раствора 1:25 до 40 мкг/мл;

— серия калибровочных растворов добавлением 100 мкл метчика и 100 мкл рабочего раствора ВС к «стандартной» биожидкости при общем объеме 5 мл.

После введения метчиков в биожидкость растворы перемешивают и оставляют на 15 — 60 минут для установления равновесия, после чего приступают к подготовке пробы согласно методике анализа.

Калибровочный график должен включать не менее трех (обычно 5 — 7) значений концентраций, равномерно распределенных по всему диапазону. Каждый из растворов готовится в трех повтор­ностях, а раствор, соответствующий пределу обнаружения (ПрО),— в 11 — 15, так как стандартное отклонение для этой величины рассматривается как характеристика точности методики.

Для ГХ/МС-анализа за величину ПрО часто берется величина, превышающая уровень шумов в 3 — 4 раза.

16.3.5. Расчет калибровочного графика

Расчет калибровочного графика проводится ЭВМ в виде зави­симости отношения площадей пиков ионов анализируемого вещества и внутреннего стандарта — 8 (АН)/8 (ВС)— от отношения концен­траций— С (АН)/С (ВС) или от концентрации анализируемого со­единения в пробе биожидкости С (АН) или в аналитической пробе Сгх(АН).

Как правило, уравнение записывается в виде, удобном для расчета неизвестной концентрации:

С =аМН2 + в х 3(ВС) ’

где

А и В — угловой коэффициент и свободный член, коэффициенты линейной регрессии, определенные по калибровочным про­бам;

Сх — концентрация анализируемого компонента в биожидко­

сти или аналитической пробе;

8 — площадь пика на ионной хроматограмме.

Калибровочный график должен быть охарактеризован по сле­дующим критериям:

— интервалу линейности;

— величине ПрО;

— коэффициенту линейной регрессии (г);

— воспроизводимости: стандартному отклонению (а) для вели­чины ПрО (п * 11 — 15) или относительному стандартному от­клонению (о / х ), где х — среднее значение, или коэффициенту вариации * (а / х ) 100%.

Устойчивость калибровочного уравнения должна проверяться каждый ^>аз при анализе новой серии проб. На практике это выражается во введении в анализируемую серию помимо «холостого” раствора не менее двух контрольных из числа калибровочных. Все растворы анализируют одновременно, строго идентично, распреде­ляя калибровочные (контрольные) растворы среди исследуемых аналитических проб. Если результаты анализа контрольных рас­творов указывают на сдвиг калибровочного графика, то необходимо делать перекалибровку в полном диапазоне.

В качестве критерия можно использовать 20%-ное отклонение контрольных результатов, определенных с помощью калибровочной прямой, от истинных, превышение которого ведет к необходимости повторения калибровки (иногда используется 10%-ный критерий).

Контрольные растворы анализируют в пяти повторностях (п = 5) и оценивают по следующим параметрам: среднее значение най­денной концентрации (х ), стандартное отклонение (а), абсолют­ное отклонение найденного среднего от фактической величины (Ах® I х —хстО. Для оценки значимости систематической по­грешности анализа контрольного результата пользуются критерием X, определяемым как

*х ,Хст = I х-хст|-\^/а.

При 1bgcolor=white>а

V/ нг/мл нг/мл нг/мл нг/мл °/

Морфин 14,8 — 16 000 14,88 16 000 19 137 883 5,5 Амфетамин 16,0— 16 000 12,9 16 000 15 877 414 2,6 тнс — СООН 0,56 — 1 600 0,67 400 386 4 0,9 Фенциклидин 0,58 — 3 600 0,58 800 796 14 1,8 Кокаин (в виде бензоилэкгонина) 7,4 — 24 000 7,4 800 781 16 2

16.4. ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГХ/МС-МЕ- ТОДА ДЛЯ АНАЛИЗА НАРКОТИЧЕСКИХ И ДРУГИХ ОДУРМАНИВАЮЩИХ СОЕДИ­НЕНИЙ

16.4.1.Идентификация методом ГХ/МС

Идентификацию наркотических и других одур­манивающих соединений, выделенных из биожидкости или при­родных объектов, а также входящих в состав нелегально продаю­щихся смесей, с использованием системы НР-5890/5971А рекомен­дуется проводить при следующих условиях.

Капиллярная кварцевая колонка НР-1 (см. 1.3) 12 мх 0,2 мм (толщина пленки фазы — 0,33 мкм); газ-носитель — гелий; давле­ние на входе в колонку — 3 пси; скорость через систему очистки прокладки — 0,8 мл/мин; скорость в системе регулирующего кла­пана — 40 мл/мин.

Ввод пробы ручной; объем 1 мкл; режим ввода — с разделением потока 1:40.

Температура инжектора 250°С, температура колонки изменяется в соответствии с программой: начальная температура 150°С под­держивается постоянной 1 минуту, далее увеличивается со скоро­стью 20 град/мин до 250°С, сохраняется неизменной 5 минут, увеличивается со скоростью 5 град/мин до 300°С. Температура интерфейса 280°С.

Условия детектирования: энергия электронов ионизации — 70 эВ, режим сканирования ионов — от 50 до 500 абс. ед. массы.

Запись хроматограммы спустя 1 минуту после ввода пробы — задержка на пик растворителя, который не регистрируется детек­тором.

При этих условиях проанализированы многие вещества, абсо­лютное время удерживания которых приведено в табл. 62.

Таблица 62, Абсолютное время удерживания некоторых наркотических и других одурманивающих соединений (условия анализа приведены в тексте)

Соединение 1, МИН Соединение 1, мин
Амфетамин 1,21 Оксазепам 7,37
Эфедрон 1,81 Каннабидиол 7,51
Эфедрин 1,95 Кодеин 7,72
Барбитал 2,52 Диазепам 8,10
Фенциклидин 3,17 Морфин 8,14
Метамфетамин 3,74 Тетрагидроканна­

бинол

8,31
Амобарбитал 4,02 Ацетилкодеин 8,50
Пентобарбитал 4,18 Хлордиазепоксид 8/66
Лидокаин 4,47 6-моноацетилмор-

фин

8,77
Кофеин 4,55 Аминазин 8,82
Гексобарбитал 4,73 Тизерцин 9,03
Тиопентал 4,76 Диацетилморфин 9,96
Фенобарбитал 5,18 Феназепам 10,81
Циклобарбитал 5,27 Нитразепам 11,61
Кокаин 6,52 Аминазин-су ль- фоксид 13,05
Медазепам 6,77 Клозапин 13,61
Дипразин 6,99 Гидазепам 16,59
Карбамазепин 7,18 Мажептил 23,99

На рис. 61 и 62 приведены хроматограммы экстрактов «уличного” героина и гашиша.

В образце «уличного» героина идентифицирован продукт аце- тилирования кодеина — ацетилкодеин, а также продукт неполного ацетилирования морфина или гидролиза диацетилморфина — мо- ноацетилморфин.

При анализе образца гашиша для определения каннабиноидов использован метод выделения ионной хроматограммы (фрагменто- граммы) характеристических ионов 231, 314 и 299. Обнаружены два вещества с временем выхода: 7,55 и 8,31 мин, которые были идентифицированы с использованием библиотечных спектров как каннабидиол и тетрагидроканнабинол соответственно.

Разделение стандартной смеси барбитуратов — барбитал, амо­барбитал, пентобарбитал, гексобарбитал, фенобарбитал, циклобар- битал — и результаты исследования экспертного образца на содер­жание барбитуратов продемонстрированы на рис. 63. В экстракте биоматериала обнаружены фенобарбитал и кофеин.

Хроматограмма стандартной смеси бензодиазепинов приведена на рис. 64. В экстракте экспертного материала доказано присутствие медазепама, оксазепама и диазепама, которые были идентифици­рованы по времени удерживания и масс-спектрам.

В

1-8,78 мин

328

327

Рис. 61. Анализ «уличного» героина

А — хроматограмма экстракта образца героина, находящегося в нелегальной про­даже: 1 — диацетилморфин; 2 — моноацетилморфин; 3 — ацетилкодеин. Б — масс- спектр пика 1, идентифицированного как диацетилморфин. В — масс-спектр пика 2, идентифицированного как моноацетилморфин

с

Б, ион 314

чЛп(Ц|»*М Шпго^* [А^шиткч! лмАк^М^ИтикУиг^^-

Б, ион 231

н^‘г^.. ^………….. ;“*“модельной смеси: 1 — барбитал; 2 — барбамил; 3 — этаминал—натрий; 4 — гексобарби- тал; 5 — фенобарбитал; 6 — цикло- барбитал. Б — хроматограмма кисло­го экстракта экспертного материала: 1 — фенобарбитал, 2 — кофеин. В — масс-спектры пиков 1 и 2, иденти­фицированных как фенобарбитал (1) и кофеин (2)

1 = 7,29
205 В
239
268
1 177 ||
, I.103 1 1
50 100 150 200 250 300 350 т/г
204

ш/2

117 В, пик 1 фенобарбитал
1-^x1 -1 ^ , 232 Ьи-Ц———— 1. —- 1—— 1 1

1 2 3

5 ^ 10 15 мин

1 *

Рис. 64. Анализ бензодиазепинов А — хроматограмма модельной сме­си: 1 — медазепам; 2 — оксазепам; 3 — диазепам; 4 — хлордиазепок- сид; 5 — феназепам; 6 — нитразе­пам. Б — хроматограмма экспертно­го материала: 1 — медазепам; 2 — оксазепам; 3 — диазепам. В — масс- спектр пика 2, идентифицированно­го как оксазепам

Для количественного определения диазепама в моче предложены следующие условия хромато-масс-спектрального анализа.

Подготовка пробы. Диазепам экстрагируется из 5мл мочи смесью растворителей (2,5 мл) толуол — гептан — изоамило­вый спирт (7:2:1) после подщелачивания до рН*9,6(5 мл 50%-ного раствора К2СО3). Эффективность экстрагирования в этих условиях составляет для 50 — 250 нг диазепама 85 — 103%. Экстракт упа­ривается досуха при нагревании не выше 40°С под слабым током азота и затем реконструируется добавлением 100 мкл метанола, содержащего 40 нг/мкл медазепама в качестве хроматографического внутреннего стандарта.

0, 6 мкл полученного раствора немедленно вводится в хромато­граф в режиме «запаздывающего разделения потока»: вюдачение разделения потока через 0,75 минуты после ввода пробы, задержка на выход пика растворителя 2,5 мин.

Температура инжектора 250°С, температура колонки 150°С со­храняется постоянной в течение 1 минуты и затем увеличивается до 250°С со скоростью 20 град/мин, следующие 5 минут температура не меняется.

Регистрация масс-спектра в режиме 81М. Ионы I группы: т/г — 242, 207, 270 — для внутреннего стандарта (медазепама) и II груп­пы: т/г — 256, 221, 284 — для анализируемого вещества (диазе­пама). Первыми указаны ионы, по которым ведется количественное определение.

Серию из 7 калибровочных растворов от 10 нг/мл до 2 мкг/мл готовили, как описано ранее, каждый раствор в трех повторностях. Полученный калибровочный график линеен во всем диапазоне кон­центраций: величина коэффициента линейной регрессии г = 0,998. Предел обнаружения — 0,5 нг/мкл аналитической пробы (сигнал: шум* 4:1). Стандартное отклонение для концентрации 5 нг/мкл (в аналитической пробе)— 1,8 и для 50 нг/мкл — 1,5.

Для оценки предложенной, методики количественного опреде­ления диазепама в моче контрольный раствор концентрации 100 нг/мл (5 нг/мкл в аналитической пробе) проанализирован в

5 повторностях.

Определено:

среднее содержание — 104 нг/мл;

стандартное отклонение — 8,8 нг/мл;

отклонение найденною и фактического значения концентра­ции — 4 нг/мл;

коэффициент вариации — 8,8%.

Доверительный интервал для р 888 95% и п = 5 составляет 104 ± 8,4 нг/мл. Оценка по 1х, хст “критерию показывает, что си­стематическая погрешность незначима: 1х, хст в течение 20 минут при 60° в герметически закрытом сосуде. После охлаждения до комнатной температуры удаляют избыток реагента в токе инертного газа или воздуха. К сухому остатку добавляют 50 — 250 мкл хло­роформа и 1 — 3 мкл пробы вводят в хроматограф.

17.3.3. ГХ/МС-анализ опиатов

Стандартные растворы морфина и кодеина после получения их производных по указанной методике хроматографируют в указан­ных выше условиях и получают масс-спектры в режиме сканиро­вания 50 — 600 а.е.м. Данные спектры сравнивают со стандартными спектрами библиотек масс-спектров А^ШЕУ, ЫВ8 и РЯе^ег. На рис. 65 приведены масс-спектры трифторацетатных (ТФА) и пента- фторпропиатных (ПФП) производных морфина и кодеина.

Таблица 63. ГХ/МС-характеристики производных опиатов

Вещество Характеристические ионы и их интенсивность, % Время удержи­вания, мин
Морфин-2ТФА 69 (34), 364 (100), 477М (22) 3,5 — 4,5
МорфиН“2ПФП 119 (22), 414 (100), 577М (51) 4,5 — 5,5
Кодеин-ТФА. 281 (29), 282 (100), 395М (61) 4,5 — 5,5
Кодеин-ПФП 282 (73), 445М (99) 5,5 — 6,5
Каннабинол 295 (100), ЗЮМ (13) 6,9 — 7,3
ТГК 299 (100), 314М (85) 7,6 — 7,9

Примечание. М — молекулярный ион.

Заключение о присутствии или отсутствии исследуемого соеди­нения в пробе проводится на основании наличия всех характери­стических ионов в соответствующем временном интервале при совпадении в пределах 5% соотношения их интенсивностей. Эти расчеты проводятся автоматически после завершения каждого ана­лиза с помощью специально разработанной программы, реализо­ванной в макрокомандах обрабатывающей станции. Оценка коли­чественного содержания исследуемых соединений проводится с ис­пользованием внешнего стандарта.

Чувствительность метода — 200 и 120 пикограмм в анализиру­емой пробе для производных морфина и кодеина и каннабиноидов соответственно.

Масс-спектры, хроматограммы трифторуксусных производных морфина и кодеина, а также результаты исследования волос че­ловека, не принимавшего наркотиков, и волос наркомана (мужчина 34 лет, последний прием наркотика — 35 дней до взятия образца) представлены на рис. 66, 67, 68.

(#1) #1: МогрЫпе 2ТРА

Рис. 66. Хроматограммы по ионам 364 и 477 а.е.м. трифторуксусных производных морфина в концентрациях 1 и 10 мкг/мл

300

I 1оп 477.00 ати. !гот02:М А1

й 1оп 477.00 ати. йхип Э2:М А11А.0

з 450 [ |

1501-■ I . ■ ■ ■ ! ■ -д -ь—■————-

10 Типе (пип.)

Рис. 67. Хроматограммы волос человека, не принимавшего кодеин или морфин

Т1С о! В2М А12А.Э 1оп 364.00 ати. Ьгот 02М А12А.Э

500



Источник: zakon.today


Добавить комментарий